探究组培中玫瑰外植体的灭菌方法

如何给原代外植体灭菌，已经成为众所周知的事情，但如何使用无毒或低毒的药品在学校等对安全需求较高的场所为外植体进行灭菌，却因为此事涉及众多方面而很难查到准确的数据。为了寻找一种适用于学校的原代外植体灭菌方式，我们决定对此一探。我们以玫瑰芽为外植体作为主要的研究材料，以不同消毒药品种类、不同消毒药品浓度、不同灭菌时间为主要变量展开研究。消毒液对细菌和植株同时产生杀伤作用，而以上三种变量正是用来调控这两种杀伤作用的主要变量。如何均衡消毒液对于二者的杀伤作用，找到一种能杀菌又不伤害到植物细胞的灭菌方法，正是我们的主要研究任务。使外植体能够得以存活，而灭菌效果达到最佳。

关键词：组织培养 原代外植体 灭菌 污染

 

 

在课外的组培课上，老师讲到了原代培养。原代培养的优点就是不会使原来植株的优良性状丧失。原代培养的灭菌药品是升汞（HgCl₂），升汞的灭菌特点是效果好，灭菌过程易于控制，但是升汞有剧毒，出于对同学安全考虑，老师只能选择放弃原代培养而选用会使原代植株的优良性状部分丧失的继代培养。这使我们想到能不能在不使用升汞的条件下，寻找一种可行的灭菌方式。消毒液要能适合学生使用，对人体无毒，使用相对安全；灭菌时间和消毒液浓度要刚好达到灭菌效果而不至于对外植体产生过大的影响。将这种灭菌方式应用到学校的组培课上，改变我校只能用无菌外植体的继代培养的现状。

 

 

 

1.植物组织培养中，细胞具有全能性。

2.灭菌的原理是，在短时间内，灭菌药品对植物无害或只对外植体的外层                             

   产生伤害，而使微生物（如细菌、真菌等）单细胞单体或群体的细胞膜结构

   遭到破坏，从而达到灭菌效果。

3.次氯酸钠（NaClO）与双氧水（H₂O₂）的灭菌效果仅次于升汞。

 

为了寻找三个自变量与灭菌效果的影响，必须先控制其中的两个变量，探究另一个变量与灭菌效果的影响。最后综合三方面因素综合考虑，得到结论。

首先将实验分为两大组，即次氯酸钠（NaClO）组与双氧水（H₂O₂）组，在每一组里划分浓度梯度，在每一个浓度的级别中设定几个时间，保证每一组里每一个浓度级别所对应的几个时间值相同。灭菌药品的浓度上升，对外植体与微生物的杀伤力都增大，时间的增加也会同时加大对外植体与微生物的伤害。由于灭菌药品的浓度的变化与灭菌时间的变化对两者伤害的改变程度不同，所以总会有一个相对应的浓度范围与时间范围，使灭菌药品对外植体与微生物的杀伤力达到均衡，即，能够有效地灭菌，且外植体不会受到太大的损伤。

在多次的试验中逐渐地缩小浓度与时间的范围，直到得到的范围可以在实际中应用为止。

 

 分组见表1所示

1.      采集玫瑰顶芽与侧芽并将采集来的经过筛选的植株放在漏网中，摊开，用流动的自来水连续冲洗30min。用洗涤灵逐一刷洗植株，并再次用自来水连续冲洗5min。用75%的酒精冲洗3min，最后用蒸馏水冲洗3次。封存在无菌水瓶里。（预处理阶段）

2.      配制MS培养基4L

3.      按照计划配制消毒药品

4.      选择大小适中的外植体，按照时间进行灭菌。

5.      接种

6.      恒温培养。

H₂O₂组无论何种浓度何种时间，培养基表面都已有大小不等的污染区，高浓度的外植体已经发黑。

NaClO组：2%10min组的三瓶已经出现污染。

          10%10min与20min的外植体已经发黑。

          其余瓶中还未出现明显的变化。

1、培养基表面都已有大小不等的污染区，说明低浓度H₂O₂的消毒能力，不足以把外来的细菌杀干净；外植体发黑说明高浓度的还会对外植体产生伤害。即，在提高双氧水的浓度时，它对微生物的杀伤能力在提高。但当双氧水的浓度还未提高到可以杀死足够多的微生物，使外植体得以产生愈伤组织的时候，双氧水对外植体的杀伤作用已经使外植体无法存活。所以排除掉双氧水作为原代外植体灭菌药品的可能性。
2、NaClO中相对低浓度且低时间组的消毒能力不好；相对高浓度的杀菌能力虽然好，但是会对外植体产生较大影响。但其余瓶中的外植体还需要继续观察。

 

NaClO 5% 20min 组的外植体已经发黑，但是瓶内没有污染。

NaClO 5% 10min 部分外植体发黑，但是瓶内没有污染。

NaClO 2% 20min 组的外植体没有什么变化，但是瓶内有少量污染。

具体瓶数见图1，图2。

          1、NaClO 5% 20min 组的外植体已经发黑，说明消毒液已经对外植体产生较大的影响，但是瓶内没有污染，说明消毒液的灭菌能力已经达到给原代外植体灭菌的要求。

          2、NaClO 5% 10min 组的外植体部分发黑，说明此种消毒液，对于外植体的损伤已经开始减小；瓶中没有污染，说明在损伤减小的同时，对于细菌的杀伤能力，还是可以用来给外植体灭菌。

          3、NaClO 2% 20min 组的外植体没有什么变化，说明此种浓度的消毒液，对于外植体的损伤，已经达到了可以忽略的地步，但是瓶内有少量污染，说明它的消毒能力还不足以给外植体消毒。

 

1、H₂O₂不适于用于原代外植体灭菌。

2、NaClO低浓度的灭菌能力弱，不能用于原代外植体灭菌；

    NaClO 高浓度的灭菌能力强，但是会对外植体产生较大的伤害，可以考虑减少消毒时间或是稍稍将浓度降低。

    3、NaClO 5% 20min 组对于外植体的损伤过大，不适于原代外植体灭菌。

    4、NaClO 5% 10min 组对外植体有一定损伤，可以考虑将浓度稍稍降低，或是将灭菌时间减少。

    5、NaClO 2% 20min 组对于细菌的杀伤力还不够，要考虑将浓度提高，或增加灭菌时间。

    6、将范围缩小到NaClO 2%~5% 10min~20min中。

在第一阶段的试验中，首先排除了双氧水作为原代外植体灭菌药品的可能性。所以要在次氯酸钠组中做更细微的浓度划分以及时间梯度划分。

在第一阶段得到的试验结论中，由于次氯酸钠具有一定的挥发性，所以把第二阶段的浓度稍微提高到3% 。由于在灭接种时菌时可能会有少量灭菌水残留在外植体上，使得灭菌时间增加，所以相应地减少了接种时间时间约5min，然后在实验时多次用无菌水涮洗灭菌完的外植体以减少误差。具体分组见4.2

 

 

   根据第一阶段的实验结果进行第二阶段的分组实验。分组见表2所示

 

 

 

 

 

 

 

 

1.      采集玫瑰顶芽与侧芽并进行预处理（预处理方法详见3.2）

2.      配制MS培养基4L

3.      按照计划配制消毒药品

4.      选择大小适中的外植体，按照时间进行灭菌。

 灭菌方法：配制好两种浓度的消毒水，放在烧杯中并用培养皿盖好。从无菌水中取出六十个已经处理好的外植体，均分成两份放入烧杯中，同时开始计时。在等待过程中将六个培养皿用蒸馏水冲洗干净，分别标记A~F，放好备用。待5min时，分别从5%和3%两个烧杯中各取出九个外植体，并分别放入A培养皿和D培养皿中。另外两个同学用无菌水多次冲洗，用小培养皿盖好。10min时再次取出外植体，放入B和E中，处理方法同上。15min组同上。

5.      接种

6.      恒温培养。

 

接种后一周，C组外植体小面积变黑，但瓶中没有污染；D组部分瓶中已经出现约1㎝²的污染区，但外植体没有变黑。其他组没有明显现象，需等待下次观察。

Ｃ组相对其他组浓度高且时间长，对外植体与微生物的杀伤能力都较强，但很明显，C组对外植体的杀伤能力已经超过了外植体的承受范围。

D组时间相对短，所以对微生物的杀伤能力不强，所以不能完成灭菌。

 

接种后两周，B组外植体部分发黑，瓶中没有有污染。部分F组外植体已经变黑，1个瓶中有污染。A组和E组外植体基本保持刚接种时的样子，瓶内也没有污染，但是外植体没有生长。

4.5.2分析

1、B组的外植体部分发黑，说明此种消毒液，对于外植体的损伤已经开始减小；瓶中没有污染，说明在损伤减小的同时，对于细菌的杀伤能力，还是可以用来给外植体灭菌。

2、F组的时间已经在第一阶段的结论时间之内，但是外植体仍变黑，说明15min对于此浓度的灭菌来说，已经太长，需要缩短时间。

3、A组与E组的结果表明，在此种浓度和消毒时间的条件下，外植体已经不会受到太大的影响，且培养瓶内的微生物数量也被控制住了。但是至于外植体没有生长的原因，可能有如下几点可能：【1】人为的操作原因【2】预处理时的酒精浓度过大，使蛋白质失活。【3】生长激素过期，使得外植体无法脱分化

1、H₂O₂和NaClO具有挥发性，可能会在灭菌的过程中逐渐挥发，使得消毒液灭菌能力有所减低。

2、无菌水没有能把残留的消毒水冲刷干净，这就会使已经接入瓶中的外植体还会与消毒液接触。这就相当于延长了灭菌时间。

3、人为的操作失误

 4、预处理时的酒精浓度过大，使蛋白质失活。

 5、生长激素过期，使得外植体无法脱分化

 

经过第一阶段与第二阶段的实验，把浓度与时间的范围缩小到了3%~5% 5min~10min 将灭菌药品确定为NaClO。这个范围已经能较好地对原代外植体进行灭菌。

 

6感想和体会 

   通过对玫瑰外植体的灭菌方法的探究，只是大致了解了在什么样的范围里面能够有较好的灭菌效果，但是在实际的应用中，还受到如外植体品种、气候状况等诸多因素的影响。在实验室中，影响灭菌效果的因素也不仅仅是所研究的那三个。所以，真正要把原代外植体培养引到校园里，还需要更多的实验论证。

 

1 谭文登，戴策刚主编 . 观赏植物组织培养技术 . 北京：中国林业出版社，1991